Discorso complesso

E’ difficile spiegare il problema che mi attanaglia sul lavoro.
Oggi ho ripetuto l’esperimento di Mercoledì scorso, per confermare il risultato. Ciò che ne è venuto fuori è un dato che al contempo avvalora e smentisce quanto prodotto in settimana, lasciandomi con in testa un discreto caos.
Vediamo se scrivere il tutto con calma, pazienza e a mente fredda mi aiuterà a trovare il bandolo della matassa.
I frutti dell’esperimento in questione sono delle attività luciferasiche X. Queste dipendono dai livelli di “Firefly” luciferasi prodotti da HeLa Cells trasfettate con costrutti plasmidici presentanti al loro interno la sequenza promotoriale in analisi. Questa è deputata a regolare la produzione della proteina, alias appunto Firefly.
Tanto più grande è il valore di X misurato, quanta più proteina è stata prodotta dalle cellule.
Perchè il valore ottenuto sia significativo, occorre tuttavia un controllo dell’efficienza di trasfezione. Su più misurazioni potrebbe infatti verificarsi una variazione di X non dovuta alla diversa attività della sequenza promotoriale studiata, ma al fatto che le cellule che hanno internalizzato il costrutto e che quindi siano in grado di produrre la proteina (quelle che si definiscono trasfettate) siano in quantità differente. Per questo motivo nelle stesse cellule si trasfetta un secondo costrutto contenente “Renilla” luciferasi controllata da una sequenza promotoriale molto forte e di sicuro e costante funzionamento, quella virale di CMV . Sarà possibile quindi misurare un’ulteriore attività N dovuta alla seconda proteina trasfettata (Renilla) e indicativa dell’efficienza di trasfezione. Il rapporto X/N consente di equiparare esperimenti dalle diverse efficienze, eliminando quindi dai dati elementi dovuti alla variabilità sperimentale.
Nelle prove fatte fino ad ora il rapporto X/N si è riconfermato, evidenziando una certa validità nel dato. Questo è molto positivo e, di conseguenza, non è qui che sta il problema.
Lo studio è volto a misurare l’attività della sequenza promotoriale quindi serve anche un termine di paragone e controllo negativo, rispetto al quale io possa esprimere quanto funziona la sequenza che sto studiando. Per fare questo dovrò trasfettare le cellule anche con un costrutto in cui prima del gene per la Firefly non si trova alcuna sequenza promotoriale. Andando a misurare Y, ovvero l’attività luciferasica di Firefly in queste cellule, potrò quantificare il background che non è altro che l’attività non dovuta all’azione della mia sequenza in analisi, bensì intrinseca. Anche l’efficienza di questa seconda trasfezione va tuttavia testata perchè sia attendibile, quindi anche in questo caso è necessario calcolare un rapporto Y/N’ come fatto in precedenza, rendendo anche questi controlli paragonabili tra loro.
Ottenuto questo valore, basterà calcolare (X/N)/Y/N’) per vedere di quante volte la mia sequenza innalza la produzione della proteina rispetto al controlo in cui questa non viene prodotta.
Facendo un esempio numerico:
X= 100000
N= 2000000
X/N= 0,05
Y= 1000
N’= 3000000
Y/N’= 0,00033
(X/N)/Y/N’)= 151,52
Questo sta a significare che la mia sequenza promotoriale innalza la sintesi della luciferasi di 152 volte circa.
Il problema consiste nel fatto che, come detto, le trasfezioni non vengono sempre nello stesso modo e una valutazione sensibile come la luminescenza amplifica le piccole differenze tra i diversi assay dovute alla manualità dell’operatore.
Perchè tutti gli scrupoli volti a normalizzare che ho scritto fino ad ora non sono d’aiuto?
La risposta è semplice. Come spiegato, l’efficienza di trasfezione è data da N e N’, numeri che di volta in volta possono variare anche di parecchio. Essendo però la variazione dovuta all’efficienza, dovrebbe variare proporzionalmente anche X poichè se più cellule hanno acquisito i costrutti esprimeranno una quantità maggiore di entrambe le luciferasi, mentre se ne avranno acquisito un minore quantitativo saranno entrambe le attività a calare. Per quanto riguarda il rapporto X/N non ci sono quindi problemi poichè, come ha senso che sia per quanto detto fino ad ora, questo si mantiene stabile. I problemi nascono invece rapportando Y ad N’ perchè se anche aumenta l’efficacia della trasfezione e più cellule accoglieranno i costrutti al loro interno, sarà solo N’ a crescere, poichè Y non dipende dall’efficienza essendo il valore dell’attività di un costrutto privo di attività. Per questo motivo andando a calcolare (X/N)/Y/N’) avrò ogni volta valori diversi, come se la mia sequenza funzionasse in maniera differente.
Questo è il nocciolo della questione.
Più ci penso e più penso che la soluzione del quesito sia banale, solo non mi viene in mente.
Devo riflettere.

Foto del giorno n°4 – Tower Bridge

* Dedicata a Peich, Orifizio, Fex e Pio. Una settimana a Londra e non l’hanno visto. Babbi.